La decisión, que contradice el tono conciliador de Putin sólo un día antes, causó consternación en Occidente, que teme que el referéndum divida a Ucrania.
El subsecretario de Estado estadounidense, William Burns, dijo que Rusia se dirigía por un "camino peligroso e irresponsable" y que la situación en Ucrania era "extremadamente inflamable".
El líder de la autodeclarada República Popular de Donetsk, Denis Pushilin, dijo que el "Consejo del Pueblo" había votado unánimemente a favor de realizar el plebiscito como estaba planeado.
"La guerra civil ya ha comenzado. El referéndum puede ponerle fin a esto y comenzar un proceso político", dijo a periodistas.
Analistas políticos dijeron que Putin podría haber esperado a que los rebeldes siguieran adelante con el referendo, en una muestra de que supuestamente ellos no están bajo sus órdenes.
Al tomar distancia del proceso que no será reconocido por las potencias de Occidente, Putin también podría evitar más sanciones, puesto que las medidas punitivas que ya enfrenta están perjudicando a la economía rusa.
El portavoz del Kremlin, Dmitry Peskov, dijo que Rusia necesitaba más información y un análisis adicional sobre la decisión tomada por los rebeldes ucranianos.
Agregó que la declaración de los rebeldes fue dada a conocer después de que el Gobierno de Kiev indicó que seguiría adelante con su operación militar en el este, sugiriendo que Ucrania tenía toda la responsabilidad por la negativa de los separatistas a escuchar a Putin.
Los mercados rusos se desplomaron luego de haber subido el miércoles, cuando Putin inesperadamente hizo un llamado para que la votación fuera postergada y declaró que sus tropas se estaban retirando de la frontera con Ucrania.
La OTAN y Estados Unidos dijeron que no tenían señales de un retiro de tropas rusas de la frontera.
Cuando el secretario general de la OTAN, Anders Fogh Rasmussen, afirmó en Twitter que no había indicios del supuesto retiro, el Ministerio de Relaciones Exteriores ruso respondió afirmando que "quienes están ciegos" deberían leer el comunicado de Putin.
La OTAN ha acusado a Moscú de usar fuerzas especiales en la toma de partes del este de Ucrania, en su mayoría de habla rusa, después de anexionar la región ucraniana de Crimea en marzo.
Putin reconoció que soldados rusos habían estado activos en Crimea después de negar inicialmente cualquier papel allí, pero dijo que no está involucrado en el este de Ucrania, una zona densamente poblada que representa casi un tercio de la producción industrial del país.
Unos 40 hombres armados atacaron un puesto fronterizo de Ucrania en el límite con Rusia el jueves y trataron de capturarlo, pero fueron repelidos por las fuerzas ucranianas, sostuvo la guardia fronteriza en Kiev.
El primer ministro de Ucrania, Arseny Yatseniuk, dijo que los comentarios conciliatorios de Putin le hacían sospechar que Moscú estaría planeado alguna forma de "escamaruza" para desacreditar a Kiev cuando el país celebra el Día de la Victoria el viernes.
Ucrania ha reforzado las medidas de seguridad para el 9 de mayo, en un nuevo aniversario de la derrota de la Alemania nazi en 1945, dijo Yatseniuk.
El inesperado pedido de Putin, seguido por la rápida decisión de los rebeldes de realizar el referendo de todas formas, ha complicado los esfuerzos de Estados Unidos y Europa por acordar una política común que podría llevar a la aplicación de sanciones más severas contra Rusia.
La Unión Europea sostuvo poco después del anuncio sobre el referéndum que estaba a la espera de ver si las palabras de Putin eran seguidas por acciones concretas. Añadió que la consulta "no tendría legitimidad democrática alguna y sólo empeorará la situación".